流式細胞術（FlowCytometry）是一種用于分析細胞群體的實驗技術，能夠同時分析單個細胞的多個特性。為了提高檢測的靈敏度和準確性，細胞通常需要經過固定（Fixation）和透化（Permeabilization）處理，以便檢測細胞內的分子（如蛋白質、DNA、RNA等）。下面是流式細胞術中固定和透化的常見解決方案。
一、固定（Fixation）
固定的目的是保持細胞內的結構和分子狀態，防止細胞在實驗過程中發生變化，通常使用化學固定劑進行處理。
常用的固定劑：
甲醛（Formaldehyde）
常用濃度：1-4%
作用：甲醛能夠通過與細胞內的蛋白質交聯，固定細胞的結構。它對細胞膜和細胞內部結構具有較強的穿透性，常用于維持細胞形態和免疫標記物的穩定性。
使用方法：
將細胞懸浮液與適量甲醛溶液混合。
4°C保存固定的細胞，避免固定時間過長，通常固定時間為15-30分鐘。
固定后的細胞可用PBS洗滌，并根據需要進行透化處理。
乙醇（Ethanol）
常用濃度：70%（體積分數）
作用：乙醇是一種廣泛使用的固定劑，適合固定DNA、RNA等分子，并能固定細胞形態。乙醇的優勢在于其良好的穿透性和與細胞膜的作用方式，可以同時破壞細胞膜，適用于之后的透化步驟。
使用方法：
細胞懸浮液加入70%乙醇，輕輕混勻。
在-20°C或4°C保存固定的細胞，常見的固定時間為30分鐘到1小時。
固定后的細胞可用PBS洗滌，并進行透化處理。
固定后注意事項：
固定細胞后需要盡快進行透化處理，避免固定過度導致標記失效。
固定過程中要保持溫度低（4°C）以減少細胞損傷。
固定劑的濃度和時間對流式細胞術結果有很大影響，需要優化。
二、透化（Permeabilization）
透化的目的是使細胞膜或細胞內的膜結構變得可滲透，從而使抗體或探針能夠進入細胞內部，標記細胞內的分子。
常用的透化劑：
TritonX-100
濃度：0.1%-0.5%
作用：TritonX-100是一種非離子表面活性劑，能夠有效地破壞細胞膜，使抗體能夠進入細胞。它對細胞膜有較強的破壞作用，可以透化大多數細胞類型。
使用方法：
固定后的細胞加入0.1%-0.5%TritonX-100溶液，輕輕混勻。
在室溫下孵育10-20分鐘，或根據實驗需要優化透化時間。
孵育后，細胞用PBS洗滌，去除透化劑。
Saponin
濃度：0.05%-0.1%
作用：Saponin是一種植物來源的透化劑，作用較為溫和，常用于細胞內標記物的檢測，特別是在對細胞膜破壞較為敏感的實驗中。它通過選擇性地破壞細胞膜的膽固醇組成，打開細胞膜上的孔隙。
使用方法：
固定后的細胞加入0.05%-0.1%Saponin溶液。
在室溫下孵育5-10分鐘，透化效果較溫和。
孵育后，用PBS洗滌細胞。
Methanol（甲醇）
濃度：100%
作用：甲醇是一種常見的透化劑，特別適用于細胞內蛋白的檢測。它通過抽提細胞內的脂質成分，從而使抗體能夠進入細胞。甲醇透化較強，但有可能破壞細胞內的某些結構，因此通常用于固定后透化。
使用方法：
固定后的細胞加入冷卻的100%甲醇。
在-20°C保存30分鐘或更長時間。
完成透化后，用PBS洗滌。
透化后注意事項：
透化時間和濃度過長可能會導致細胞膜或細胞內部結構的過度破壞，影響實驗結果。
不同細胞類型對透化劑的反應不同，可能需要優化透化條件。
透化和固定處理后，應盡量避免長時間暴露在室溫下，避免細胞損傷。
三、固定與透化的綜合流程
細胞培養與收集
收集待檢測的細胞，使用PBS洗滌去除培養基。
固定處理
根據實驗需要選擇固定劑（如甲醛、乙醇等）。
按照推薦的濃度和時間對細胞進行固定。
固定后使用PBS洗滌細胞。
透化處理
根據實驗要求選擇透化劑（如TritonX-100、Saponin、Methanol等）。
按照推薦濃度和時間對細胞進行透化。
透化后用PBS洗滌細胞，去除透化劑。
抗體染色與檢測
固定和透化后的細胞可以進行表面標記或內部分子標記。
使用適當的熒光標記抗體，進行流式細胞術分析。
四、總結
在流式細胞術中，細胞固定和透化是兩個非常關鍵的步驟。固定劑能夠保持細胞結構并防止分子降解，而透化劑能夠使抗體或其他探針進入細胞，標記內部分子。選擇適當的固定和透化條件對于確保實驗的準確性和重復性至關重要。因此，建議根據細胞類型、實驗目標和抗體性質來優化固定和透化的方案。
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